Меню

Пцр на африканскую чуму свиней

0 Comments

Содержание:

Использование мембранных фильтров при индикации ДНК вируса африканской чумы свиней в комбикорме с помощью ПЦР-РВ Текст научной статьи по специальности «Сельское и лесное хозяйство»

Аннотация научной статьи по сельскому и лесному хозяйству, автор научной работы — Кудряшов Д. А., Каторкин С. А., Аронова Е. В., Бурдинская О. Н., Моргунов Ю. П., Газаев И. Х., Цыбанов С. Ж., Колбасов Д. В.

Известно, что распространение вируса африканской чумы свиней ( АЧС ) происходит при алиментарной передаче возбудителя (например, вследствие использования контаминированных вирусом пищевых и боенских отходов, не подвергнутых термической обработке, комбикормов , не прошедший ветеринарно-санитарную экспертизу и поступающий из районов, неблагополучных по АЧС , в случаях, когда перевозка комбикорма осуществлялась в транспортных средствах, не подвергшихся ветеринарно-санитарной обработке). При анализе комбикормов с использованием метода полимеразной цепной реакции в режиме реального времени ( ПЦР-РВ ) одно из требований заключается в тщательной очистке образцов от крупных частиц и различных химических примесей, которые могут ингибировать реакцию, изменять свойства сорбента и мембранных фильтров на стадии выделения нуклеиновых кислот. Наша цель заключалась в разработке методики пробоподготовки с использованием мембранных фильтров для изучения возможности индикации ДНК вируса африканской чумы свиней в искусственно контаминированном комбикорме с помощью ПЦР. Для контаминации использовали кровь от свиньи, экспериментально зараженной вирусом АЧС (штамм Ставрополь 2009) с инфекционным титром 5,0 lg ГАЕ 50/см 3. Рабочие разведения вируссодержащего материала 2,0; 3,0; 4,0 и 5,0 lg ГАЕ 50/см 3. Подготовка проб включала фильтрование через марлю, замораживание-оттаивание, низкоскоростное центрифугирование и разделение на фильтрах с диаметром пор 450 мкм. Последующее выделение ДНК вируса АЧС и ПЦР-РВ выполняли согласно инструкции по применению соответствующей разработанной тест-системы. Установлено, что в подготовленных предложенным способом пробах искусственно контаминированного комбикорма ДНК вируса АЧС выявляется в материале с титром вируса не менее 3,0 lg ГАЕ 50/см 3. Таким образом, включение в диагностическую схему рекомендуемой стадии подготовки проб, описанной выше, при анализе комбикорма позволяет получить очищенный от примесей и сконцентрированный материал, который может быть использован для дальнейших исследований на наличие ДНК вируса АЧС с помощью ПЦР-РВ .

Похожие темы научных работ по сельскому и лесному хозяйству , автор научной работы — Кудряшов Д.А., Каторкин С.А., Аронова Е.В., Бурдинская О.Н., Моргунов Ю.П., Газаев И.Х., Цыбанов С.Ж., Колбасов Д.В.,

For African swine fever (ASF) virus an alimentary transmission way is known to be characteristic. In particular, the infection occurs because of use of the contaminated domestic and slaughtering wastes or the feed compounds originated from epizootic region which have not been duly controlled, or in case the package used for feed transportation were not treated against African swine virus. Under feed compound analysis by real-time PCR (RT-PCR), the samples must be free from large particles and chemical substances which can inhibit the polymerase reaction and influence the sorbent and membrane properties during nucleic acid isolation. We aimed to improve the feed compound processing technique by using membrane filters to prepare the samples for further RT-PCR indication of ASF virus. In the experiments, the feed was artificially contaminated by blood of a swine previously infected by the ASF virus Stavropol 2009 strain, the titer of 5.0 lg HAD 50/sm 3. Also the dilutions of 2.0, 3.0 and 4.0 HAD 50/sm 3 were tested. During processing, the crud filtration, freezing-defrostation procedure, centrifugation and separation on membrane filters (450 mm) were applied. Then the ASF virus DNA isolation and PCR-RT were conducted using the developed test-system and procedure. It was found out that the ASF virus DNA can be detected by the proposed method in the feed compound when the titer of virus used for artificially contaminated is at least 3.0 lg HAD 50/sm 3. So, the modifying procedure of fodder sample preparation described hereinabove is effective to obtain purified and concentrated material for further ASF virus DNA analysis.

Текст научной работы на тему «Использование мембранных фильтров при индикации ДНК вируса африканской чумы свиней в комбикорме с помощью ПЦР-РВ»

СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, № 4, с. 75-79

УДК 636.4:619:578.835.2:636.085:577.2:57.083 doi: 10.15389/agrobiology.2014.4.75rus

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕМБРАННЫХ ФИЛЬТРОВ ПРИ ИНДИКАЦИИ ДНК ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ В КОМБИКОРМЕ

С ПОМОЩЬЮ ПЦР-РВ

Д.А. КУДРЯШОВ, С.А. КАТОРКИН, Е.В. АРОНОВА, О.Н. БУРДИНСКАЯ, Ю.П. МОРГУНОВ, И.Х. ГАЗАЕВ, С.Ж. ЦЫБАНОВ, Д.В. КОЛБАСОВ

Известно, что распространение вируса африканской чумы свиней (АЧС) происходит при алиментарной передаче возбудителя (например, вследствие использования контаминирован-ных вирусом пищевых и боенских отходов, не подвергнутых термической обработке, комбикормов, не прошедший ветеринарно-санитарную экспертизу и поступающий из районов, неблагополучных по АЧС, в случаях, когда перевозка комбикорма осуществлялась в транспортных средствах, не подвергшихся ветеринарно-санитарной обработке). При анализе комбикормов с использованием метода полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) одно из требований заключается в тщательной очистке образцов от крупных частиц и различных химических примесей, которые могут ингибировать реакцию, изменять свойства сорбента и мембранных фильтров на стадии выделения нуклеиновых кислот. Наша цель заключалась в разработке методики пробоподготовки с использованием мембранных фильтров для изучения возможности индикации ДНК вируса африканской чумы свиней в искусственно контаминиро-ванном комбикорме с помощью ПЦР. Для контаминации использовали кровь от свиньи, экспериментально зараженной вирусом АЧС (штамм Ставрополь 2009) с инфекционным титром 5,0 lg ГАЕ5о/см3. Рабочие разведения вируссодержащего материала — 2,0; 3,0; 4,0 и 5,0 lg ГАЕ50/см3. Подготовка проб включала фильтрование через марлю, замораживание-оттаивание, низкоскоростное центрифугирование и разделение на фильтрах с диаметром пор 450 мкм. Последующее выделение ДНК вируса АЧС и ПЦР-РВ выполняли согласно инструкции по применению соответствующей разработанной тест-системы. Установлено, что в подготовленных предложенным способом пробах искусственно контаминированного комбикорма ДНК вируса АЧС выявляется в материале с титром вируса не менее 3,0 lg ГАЕ50/см3. Таким образом, включение в диагностическую схему рекомендуемой стадии подготовки проб, описанной выше, при анализе комбикорма позволяет получить очищенный от примесей и сконцентрированный материал, который может быть использован для дальнейших исследований на наличие ДНК вируса АЧС с помощью ПЦР-РВ.

Ключевые слова: африканская чума свиней, АЧС, вирус африканской чумы свиней, комбикорм, пробоподготовка, мембранные фильтры, ПЦР в реальном времени, ПЦР-РВ.

Африканская чума свиней (АЧС) — особо опасное высококонтагиозное заболевание, из-за участившихся вспышек которого вопросы диагностики, механизмов патогенеза, эпизоотический мониторинг требуют постоянного внимания специалистов (1-5). Вирус АЧС, который относится к наиболее опасным и экономически значимым патогенам, передается в основном алиментарно (6, 7). Этот способ подразумевает использование для кормления пищевых и боенских отходов, не подвергнутых термической обработке, которые контаминированы вирусом (6). Кроме того, источником заражения может служить комбикорм, не прошедший ветеринарносанитарную экспертизу и поступающий из районов, неблагополучных по АЧС (8). Перевозка комбикорма в транспортных средствах, не подвергшихся ветеринарно-санитарной обработке, хранение в помещениях, инфицированных возбудителем, также может привести к попаданию в него вируса и, как следствие, к заражению поголовья.

Таким образом, поставка комбикорма, контаминированного вирусом АЧС, в благополучные по инфекции регионы, представляет серьезную угрозу для свиноводческих хозяйств как в промышленном, так и в частном секторе. При анализе комбикормов с использованием метода полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) одно из требований заключается в тщательной очистке образцов от крупных час-

тиц и различных химических примесей, которые могут ингибировать реакцию, изменять свойства сорбента и мембранных фильтров на стадии выделения нуклеиновых кислот (НК).

Следует также отметить, что масса образцов комбикорма, поступающих в лабораторию, составляет 3-5 кг, и из-за неравномерного распределения возбудителя в таком большом объеме исследуемого материала существует проблема формирования средней пробы (9). Поэтому возникает необходимость введения дополнительной стадии пробоподготовки при индикации генома вируса АЧС в комбикорме с помощью ПЦР-РВ.

Общая схема пробоподготовки комбикорма была разработана ранее Н.А. Лагуткиным с соавт. (10). Однако эта схема не оптимизирована для конкретного возбудителя (вируса АЧС) и не применялась при исследовании проб комбикорма с помощью ПЦР-РВ.

Наша цель заключалась в разработке методики пробоподготовки с использованием мембранных фильтров для изучения возможности индикации ДНК вируса африканской чумы свиней в искусственно контамини-рованном комбикорме с помощью ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ).

Методика. В эксперименте использовали комбикорм для свиней, в состав которого входят отруби пшеничные, ячмень 2-го класса, мучка ячменная, мел кормовой, жмых подсолнечный, премикс П55 (КК-55 комбикорм для мясного откорма свиней, «Агрос», Россия). Навески комбикорма (4 шт. по 300 г) контаминировали вируссодержащей кровью (30 см3 на каждую пробу), которую получали от свиньи, экспериментально зараженной вирусом АЧС (штамм Ставрополь 2009). Инфекционный титр в исходном препарате крови составлял 5,0 lg ГАЕ50/см3 (1-я навеска), 2-ю навеску контаминировали разведением вируссодержащего материала с титром 4,0; 3-ю — с титром 3,0 и 4-ю — 2,0 lg ГАЕ50/см3. Комбикорм тщательно перемешивали для равномерного распределения вируссодержащего материала по всей массе.

Для элюции вируса в комбикорм добавляли стерильный физиологический раствор в соотношении 1:5 (масса/объем) и перемешивали в течение 5-10 мин при комнатной температуре. Для отработки условий концентрирования и очистки вируса использовали 1-ю навеску комбикорма. Суспензию фильтровали через 8 слоев стерильной марли. Затем полученную жидкость разделили на три аликвоты. Аликвоту № 1 однократно замораживали при температуре -60 °С. После оттаивания при комнатной температуре пробы осветляли низкоскоростным центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 мин на центрифуге Eppendorf 5804 (Германия). Полученный супернатант пропускали через мембранный фильтр с диаметром пор 450 мкм (ФМНЦ-0,45) («Владисарт», Россия). Для аликвоты № 2 исключали этап замораживания-оттаивания. Пробу центрифугировали при вышеуказанных условиях, полученный супернатант фильтровали. Аликвоту № 3 фильтровали без предварительного замораживания-оттаивания и центрифугирования.

Следующий этап пробоподготовки был одинаковым для всех аликвот: фильтры измельчали в стерильной фарфоровой чашке со стерильным стеклом; добавляли 0,2 см3 деионизированной воды и 1,0 см3 лизирующего буфера, входящего в состав набора для выделения нуклеиновых кислот («Тест-система для выявления ДНК вируса АЧС методом ПЦР в реальном времени», разработка и производство Всероссийского НИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии) (11). Полученную жидкость отбирали в чистые пробирки объемом 1,5 см3, центрифугировали при 13 400 об/мин в

течение 30 с на центрифуге Eppendorf mini spin (Германия). Супернатант использовали для выделения НК.

Остальные навески комбикорма (со 2-й по 4-ю) подвергались всем перечисленным процедурам подготовки: приготовление суспензии, фильтрование через марлю, замораживание-оттаивание, центрифугирование, осаждение на мембранном фильтре, получение супернатанта для дальнейшего выделения НК.

ДНК выделяли по модифицированной методике R. Boom с соавт.

(12). Постановку ПЦР-РВ осуществляли в амплификаторе Rotor Gene 6000 («Qiagen», Германия) в соответствии с инструкцией по применению тестсистемы для выявления ДНК вируса АЧС методом ПЦР в реальном времени (11). Учет результатов ПЦР проводили, анализируя кривые накопления флуоресцентного сигнала с помощью программного обеспечения используемого амплификатора.

Результаты. Выбор диаметра мембранного фильтра основывался на данных, полученных A. Lucas с соавт. (13) в опытах по фильтрованию крови и сыворотки через фильтры Шамберлана, Беркефельда и Зейтца с разным диаметром пор (300, 450, 500, 1000 мкм). Авторами было установлено наличие вируса в фильтратах при диаметре пор 300 и 450 мкм и его отсутствие в фильтратах при диаметре пор 500 и 1000 мкм (7).

При сравнении различных вариантов подготовки проб с исключением некоторых стадий оказалось, что в этих случаях поры фильтра забивались крупными и вязкими частицами комбикорма (аликвоты № 2 и № 3), что делало невозможным накопление фильтрата для последующего выделения НК и постановки ПЦР-РВ. При сохранении всех этапов (аликвота № 1) был получен фильтрат, который использовали на дальнейших стадиях выявления ДНК вируса АЧС с помощью ПЦР-РВ.

В ПЦР-РВ на матрицах ДНК, выделенных из 1-й (аликвота № 1), 2-й, 3-й и 4-й навески комбикорма, положительный результат регистрировали в 1-3-м образцах (рис.). В пробе № 4, контаминированной кровью с наиболее низким титром вируса (2,0 ^ГАЕ50/см3), геном вируса АЧС не обнаружили.

График накопления флуоресцентного сигнала при использовании ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) для анализа образцов комбикорма, контаминирован-ных инокулятами вируса африканской чумы свиней с разным инфекционным титром: 1 —

1- я навеска (аликвота № 1),

2- 4 — соответственно 2-4-я навески, 5 — отрицательный контроль выделения ДНК, 6 — положительный контроль выделения ДНК, 7 — отрицательный контроль ПЦР-РВ,

8 — положительный контроль ПЦР-РВ (подробное описание условий инокуляции и оптимизированной подготовки проб см. в разделе «Методика»).

Значения порогового цикла, зарегистрированные при исследовании 1-3-й навесок комбикорма, находились в прямой зависимости от величины инфекционного титра вируса в образцах: для 1-й навески величина Ct была наименьшей и равнялась 19,60, тогда как у 3-й навески достигала максимального значения, равного 25,91 (табл.).

Средние значения порогового цикла (Q) при использовании ПЦР в реальном времени (РВ-ПЦР) для анализа образцов комбикорма, контаминированных инокулятами вируса африканской чумы свиней с разным инфекционным титром (п = 3)

1 1-я навеска комбикорма (аликвота № 1) 19,60

2 2-я навеска комбикорма 22,64

3 3-я навеска комбикорма 25,91

4 4-я навеска комбикорма н.з

5 Отрицательный контроль выделения ДНК н.з

6 Положительный контроль выделения ДНК 18,35

7 Отрицательный контроль ПЦР-РВ н.з

8 ___Положительный контроль ПЦР-РВ 13,88

Примечание. Подробное описание условий инокуляции и оптимизированной подготовки проб см. в разделе «Методика»; н.з. — нет значения Ct.

Таким образом, при исследовании комбикорма на наличие генома вируса африканской чумы свиней (АЧС) с помощью ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) в диагностическую схему рекомендуется включать стадию подготовки проб, состоящую из приготовления суспензии, фильтрования через марлю, замораживания-оттаивания, низкоскоростного центрифугирования и осаждение на фильтрах с диаметром пор 450 мкм. Проведение полного цикла пробоподготовки комбикорма позволяет получить очищенный от примесей и сконцентрированный материал, который может быть использован для дальнейших исследований на наличие ДНК вируса АЧС с помощью ПЦР-РВ. В подготовленных таким способом образцах ДНК вируса АЧС выявляли при титре от 3,0 lg ГАЕ5о/см3.

1. S a nchez-Vizca 1 no J.M., Mur L. African swine fever diagnosis update. Dev. Biol. (Basel), 2013, 135: 159-165 (doi: 10.1159/000189240).

2. Nigsch A., Costard S., Jones B.A., P fe iffe r D.U., Wie l a nd B. Stochastic spatio-temporal modelling of African swine fever spread in the European Union during the high risk period. Prev. Vet. Med., 2013, 108(4): 262-275 (doi: 10.1016/j.prevetmed.2012.11.003).

3. Atuhaire D.K., Afayoa M., Ochwo S., Mwesigwa S., Mwiine F.N., Okuni J.B., Olaho-Mukani W., Ojok L. Prevalence of African swine fever virus in apparently healthy domestic pigs in Uganda. BMC Vet. Res., 2013, 9: 263 (doi: 10.1186/1746-6148-9-263).

4. De Carvalho Ferreira H.C., Backer J.A., Weesendorp E., Klinkenberg D., Stegeman J.A., L o e f f e n W.L. Transmission rate of African swine fever virus under experimental conditions. Vet. Microbiol., 2013, 165(3-4): 296-304 (doi: 10.1016/j.vetmic.2013.03.026).

5. G o mez-Villamandos J.C., Bautista M.J., S a nchez-Cord o n P.J., Carrasco L. Pathology of African swine fever: the role of monocyte-macrophage. Virus Res., 2013, 173(1): 140-149 (doi: 10.1016/j.virusres.2013.01.017).

6. Бакулов И.А. Африканская чума свиней. М., 1969.

7. Козлова Д.И., Бесхлебнов В.А. Современные проблемы африканской чумы свиней. M., 1980.

8. Атражева Т.А. Ветеринарно-санитарная оценка комбикормов, используемых в кормлении свиней. В кн.: Пути повышения качества продуктов животноводства и их ветеринарно-санитарная оценка. Киев, 1981.

9. ГОСТ 13496.0-80 «Комбикорма, сырье, методы отбора проб». М., 1980.

10. Руководство по индикации особо опасных болезней сельскохозяйственных животных в объектах ветеринарного надзора и окружающей среды /Под ред. Н.А. Лагут-кина, В.Н. Смирнова, В.В. Куриннова, С.Ж. Цыбанова. М., 2000.

11. Газаев И.Х., Елсукова А.А., Синдрякова И.П., Цыбанов С.Ж., Кол-басов Д.В. Применение метода ПЦР в режиме реального времени для выявления вируса африканской чумы свиней. В сб.: Молекулярная диагностика-2010. М., 2010: 83-85.

12. Boom R., Sol C.J., Salimans M.M. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol., 1990, 28(3): 495-503.

13. Lucas A., Haag J., Larenaudie B. La peste porcine africaine. Collection de mono-graphies. Paris, 1967.

ГНУ Всероссийский НИИ ветеринарной Поступила в редакцию

вирусологии и микробиологии Росселъхозакадемии, 31 марта 2014 года

601120 Россия, Владимирская обл., Петушинский р-н, г. Покров, e-mail: kolbasovdenis@gmail.com, is.gazaev@mail.ru

THE USE OF MEMBRANE FILTERS IN DETECTION OF THE ASF VIRUS DNA IN THE FEED COMPOUND BY RT-PCR

D.A. Kudryashov, S.A. Katorkin, E.V. Aronova, O.N. Burdinskaya, Yu.P. Morgunov,

I.Kh. Gazaev, S.Zh. Tsybanov, D.V. Kolbasov

All-Russian Institute of Veterinary Virology and Microbiology, Russian Academy of Agricultural Sciences, Pokrov, Petushinskii Region, Vladimir Province, 601120 Russia, e-mail kolbasovdenis@gmail.com, is.gazaev@mail.ru Received March 31, 2014 doi: 10.15389/agrobiology.2014.4.75eng

For African swine fever (ASF) virus an alimentary transmission way is known to be characteristic. In particular, the infection occurs because of use of the contaminated domestic and slaughtering wastes or the feed compounds originated from epizootic region which have not been duly controlled, or in case the package used for feed transportation were not treated against African swine virus. Under feed compound analysis by real-time PCR (RT-PCR), the samples must be free from large particles and chemical substances which can inhibit the polymerase reaction and influence the sorbent and membrane properties during nucleic acid isolation. We aimed to improve the feed compound processing technique by using membrane filters to prepare the samples for further RT-PCR indication of ASF virus. In the experiments, the feed was artificially contaminated by blood of a swine previously infected by the ASF virus Stavropol 2009 strain, the titer of 5.0 lg HAD50/sm3. Also the dilutions of 2.0, 3.0 and 4.0 HAD50/sm3 were tested. During processing, the crud filtration, freezing-defrostation procedure, centrifugation and separation on membrane filters (450 pm) were applied. Then the ASF virus DNA isolation and PCR-RT were conducted using the developed test-system and procedure. It was found out that the ASF virus DNA can be detected by the proposed method in the feed compound when the titer of virus used for artificially contaminated is at least 3.0 lg HAD50/sm3. So, the modifying procedure of fodder sample preparation described hereinabove is effective to obtain purified and concentrated material for further ASF virus DNA analysis.

Keywords: African swine fever, ASF, African swine fever virus, feed compound, sample preparation, membrane filters, RT-PCR.

Редакция журнала «Сельскохозяйственная биология» выполняет рассылку электронных оттисков опубликованных статей

Для получения электронного оттиска Вам необходимо:

отослать точное описание заказа (авторы и название статьи, год, номер журнала, страницы) по адресу agrobiol@mail.ru, указав Ваши фамилию, имя, отчество (полностью), город, где проживаете, контактные e-mail и телефон;

❖ получить из редакции по своему e-mail подтверждение заказа (с присвоенным ему номером);

❖ оплатить услугу, указав в платежном документе в графе «Назначение платежа» присвоенный заказу номер и Ваши фамилию, имя, отчество.

Оттиски высылаются на Ваш контактный e-mail после зачисления оплаты на счет редакции.

Банковские реквизиты редакции:

Получатель: Банк получателя:

ИНН 7708051012 Редакция журнала «Сельскохозяйственная Сбербанк России ОАО г. Москва, биология», Марьинорощинское ОСБ 7981, БИК 044525225,

г. Москва, р/с 40703810638050100603 к/с 30101810400000000225

В назначении платежа укажите номер заказа, Ваши фамилию, имя, отчество.

один оттиск — 120 руб.,

❖ не более шести оттисков (абонемент) — 360 руб.,

❖ не более двенадцати оттисков (абонемент) — 700 руб.

НДС не облагается.. Абонементное обслуживание предполагает предоставление указанного числа оттисков за период не более каждого текущего года по предоплате.

E-mail для заказа электронных оттисков — agrobiol@mail.ru

© Электронные оттиски являются интеллектуальной собственностью редакции журнала «Сельскохозяйтвен-ная биология». Внесение в них каких бы то ни было изменений и дополнений не допускается. Перепечатка, тиражирование, размещение в средствах информации, в том числе электронных и сети Интернет, а также коммерческое распространение возможны только с разрешения редакции.

Пцр на африканскую чуму свиней

АРХИВ «Студенческий научный форум»

Просмотров научной работы: 2648

Поделиться с друзьями:

Отбор проб для вирусологических исследований. Для обнаружения вируса африканской чумы свиней, антигена или генома от павших или убитых с диагностической целью свиней отбирают массой 5-10 г — селезёнку (1/3 часть), портальные, желудочные и подчелюстные (или мезентериальные) лимфоузлы (целиком), лёгкое (5х5 см) и почку (1/3 часть), 3-5 мл крови (или сгусток). Кроме того, рекомендуется в случае аутолизиса трупа отбирать грудинную или трубчатую кость.

Отбор проб для серологических исследований. Минимальное количество проб, которые должны быть отобраны для серологических исследований, рассчитывают с учётом 10%-ой серопревалентности заболевших с 95%ой достоверностью для обследования каждого помещения.

Пробы крови отбирают их полой вены не менее 10 мл от каждой свиньи [3].

Для лабораторных исследований применяют следующие методы: реакцию гемадсорбции (РГАд) в культурах клеток, реакцию прямой иммунофлюоресценции (РПИФ), полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в формате электофорезной детекции, ПЦР в формате реального времени, применяют твёрдофазный иммуноферментный анализ (ТФ – ИФА) (сэндвич-вариант). В сомнительных случаях окончательный диагноз устанавливают заражением подозрительным материалом (кровь, суспензия селезенки и лимфатических узлов) свиней, вакцинированных против классической чумы. Заражение свиней (биопроба) проводят в специализированной лаборатории с соблюдением особых мер предосторожности. Серологические типы вируса определяют в реакции преципитации (РП), реакции связывания комплемента (РСК), реакции задержки геамадсорбции (РЗГАд) и другими методами. [2]

Для обнаружения антигена африканской чумы свиней применяют реакцию гемадсорбции (РГАд) в культурах клеток костного мозга (ККМС) или лейкоцитов свиней (ЛС), содержащих эритроциты и последующем обнаружении гемадсорбции ставят в вирусологических лабораториях. Для этого культуру клеток ЛС или ККМС 2-3 суточного возраста, выращенную на стеклянных пластинках из покровных стекол в пробирках (чашках Карреля), заражают экстрактами суспензий органов и кровью и через 24, 48, 72, 96 и 192 часа после инокуляции культуру клеток просматривают под световым микроскопом на наличие гемадсорбции. В положительных случаях наблюдают гемадсорбцию эритроцитов на пораженных вирусом клетках в виде ягоды «малины» [4].

Реакция прямой иммунофлуоресценции (РПИФ) ставят в вирусологических лабораториях для прямого обнаружения вирусного антигена в клетках органов свиней, подозреваемых в заражении вирусом африканской чумы свиней. Внутриклеточный антиген обнаруживают люминесцентной микроскопией препаратов мазков-отпечатков, окрашенных ФИТЦ-иммуноглобулинами (специфические антитела к вирусу африканской чумы свиней, меченные флуоресцеинизотиацианатом). Лучшими органами для РПИФ являются селезёнка и лимфоузлы. Исследование может быть выполнено в течение 2-4 час [2].

Для выполнения реакции используют «Набор препаратов для дифференциальной иммунофлуоресцентной диагностики африканской чумы свиней (АЧС), классической чумы свиней (КЧС) и болезни Ауески (БА)» или сертифицированные коньюгаты ФИТЦ-иммуноглобулины АЧС, произведённые отдельно во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии (ВНИИВВиМ), г. Покров Владимирская область.

Оценку результатов микроскопии проводят по условной четырех крестовой шкале при окуляре 10х20-объективе 10. В положительных случаях наблюдают сверкающую, желто-зеленого цвета флуоресценцию клеток с включениями или очаговыми флуоресцирующими комплексами диффузного и гранулярного антигена, в одном из 10-50 полей зрения.

Для обнаружения антигена и антител против вируса африканской чумы свиней применяют твёрдофазный иммуноферментный анализ (ТФ – ИФА) (сэндвич-вариант) основанный на взаимодействии иммобилизированных на поверхности лунок планшет специфических к вирусу АЧС иммуноглобулинов со специфическими антигенами АЧС и последующим выявлением комплекса «антиген-антитело» специфическим к вирусу АЧС конъюгатом антител, меченным пероксидазой хрена (коньюгат ПХ-АЧС). Пероксидаза вызывает разложение находящейся в хромоген-субстратном растворе перекиси водорода и окисление хромогена, в результате чего в лунках развивается окраска субстрата, интенсивность которой прямо пропорциональна количеству антигена в определяемой пробе. В случае отсутствия антигена, коньюгат ПХАЧС (т.е. ПХ) удаляется отмывочным раствором и окраска отсутствует.[3]

При визуальном учёте реакцию считают положительной при окрашивании хромогенного субстратного раствора в лунках, в которых предварительно инкубировали исследуемые и специфический антиген в сине-зеленый цвет и отсутствии окрашивания субстрата в лунках, в которых предварительно инкубировали нормальный антиген.

Для обнаружения генома вируса африканской чумы свиней применяют ПЦР в формате электофорезной детекции. Для выполнения используют «Тест-систему для выявления ДНК вируса АЧС методом ПЦР» (производство ГНУ ВНИИВВиМ). Принцип реакции заключается в многократном повторении циклов денатурации исследуемой ДНК при температуре 94°С, гибридизации ДНК со специфическими праймерами при температуре 53°С и синтеза с них комплементарных цепей ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы при температуре 72°С. В результате амплификации концентрация синтезированного фрагмента в исследуемой пробе увеличивается в миллионы раз, что позволяет визуально учитывать результаты анализа с помощью электрофореза в агарозном геле [1].

Анализ по выявлению вируса АЧС включает выделение ДНК и амплификации специфического фрагмента в полимеразной цепной реакции и электрофорез в агарозном геле [3].

Результаты электрофореза просматривают в ультрафиолетовом свете с длинной волны 254 нм на приборе «Трансиллюминатор». Результаты реакции выявляются в виде светящихся полос оранжевого цвета.

Реакция считается положительной, если полоса в соответствующем треке располагается в геле точно на таком же расстоянии от старта, что и полоса положительного контроля амплификации. Размер апликонов после проведения ПЦР- 485 п.н.

Реакция считается отрицательной, если в соответствующих треках полос не обнаружено или полосы не соответствуют по размеру фрагменту в контрольной пробе (т. е. располагаются на другом расстоянии от старта) [4].

Для обнаружения антигена вируса африканской чумы свиней применяют ПЦР в формате реального времени. Реакции заключается в использовании специфического флюоресцентно-меченного зонда, сайт гибридизации которого лежит между сайтами связывания основных диагностических праймеров. В случае присутствия в исследуемом образце генома возбудителя, зонд будет связываться с его ДНК и прибор регистрирует накопление флуоресцентного сигнала в ходе реакции. Регистрация сигнала происходит через стенки пробирки в режиме реального времени [1].

Учёт результатов проводят по анализу кривых накопления флуоресцентного сигнала по каналу FAM с помощью программного обеспечения используемого прибора.

Положительными считают результаты реакции при значениях Ct, не превышающих 35.

Образцы, для которых не определено значение Ct (кривая флуоресценции не пересекает пороговую линию) – результаты считают отрицательными [4].

Белоусова Л.В., Троценко Н.И., Преображенская Э.А. Практикум по ветеринарной вирусологии. М.: КолосС, 2006. — 248 с [Текст] с.131-140.

Госманов Р.Г., Колычев Н.М. Ветеринарная вирусология М.: KoлoсC, 2006. — З04 c. [Текст] с.151-153.

Инфекционные болезни животных / Б.Ф. Бессарабов, А.А., Е.С. Воронин и др.; Под ред. А.А. Сидорчука. — М.: Колосс, 2007.-671с [Текст] с.206-275.

Шевченко А.А., Шевченко Л.В., Черных О.Ю., Шевкопляс В.Н. Лабораторная диагностика инфекционных болезней животных. Учебное пособие. Краснодар. – 2009. – 575 С. [Текст] с.340-402

Диагностика африканской чумы свиней в Российской Федерации Текст научной статьи по специальности «Сельское и лесное хозяйство»

Аннотация научной статьи по сельскому и лесному хозяйству, автор научной работы — Гребенникова Т. В., Забережный А. Д., Алипер Т. И., Верховский О. А., Непоклонов Е. А.

В представленном обзоре рассмотрены основные молекулярно-генетические характеристики вируса Африканской чумы свиней ( АЧС ), а также методы диагностики АЧС и особенности их применения.

Похожие темы научных работ по сельскому и лесному хозяйству , автор научной работы — Гребенникова Т.В., Забережный А.Д., Алипер Т.И., Верховский О.А., Непоклонов Е.А.,

Diagnostics of African swine fever in Russian Federation

In this review the basic molecular-genetic characteristics of the African swine fever (ASF) virus, as well as methods of diagnosis of ASF and especially their application depending has been considered.

Текст научной работы на тему «Диагностика африканской чумы свиней в Российской Федерации»

Т.В. Гребенникова1, А.Д. Забережный 1, Т.И. Алипер \ О.А. Верховский 3,

Е.А. Непоклонов 2

Диагностика африканской чумы свиней в Российской Федерации

1 ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России, Москва

2 Федеральная служба по ветеринарному и фитосанитарному надзору, Москва

3 АНО «НИИ диагностики и профилактики болезней человека и животных», Москва.

В представленном обзоре рассмотрены основные молекулярно-генетические характеристики вируса Африканской чумы свиней (АЧС), а также методы диагностики АЧС и особенности их применения.

Ключевые слова: африканская чума свиней, АЧС, вирус африканской чумы свиней,

T. V. Grebennikova1, А.D. Zaberezhny1, T.I. Anunep l, O.A. Verkhovsky 3, E.A. Nepoklonov2

Diagnostics of African swine fever in Russian Federation

1 D.I. Ivanovsky Institute of Virology, Russian Ministry of Public Health, Moscow 2 Federal Service for Veterinary and Phytosanitary Surveillance, Moscow 3 DPRI Center for Diagnostics and Prevention of Human and Animal Diseases, Moscow

In this review the basic molecular-genetic characteristics of the African swine fever (ASF) virus, as well as methods of diagnosis of ASF and especially their application depending has been considered.

Ключевые слова: African swine fever, ASF, African swine fever virus, diagnostics.

Африканская чума свиней (АЧС) — высококонтагиозное вирусное заболевание свиней, характеризующееся высокой летальностью и наносящее огромный экономический ущерб свиноводству. АЧС вызывается ДНК-содержащим вирусом сем. Asfarviridae, рода Asfvirus [1]. Важнейшей эпизоотологической особенностью АЧС является быстрое изменении форм течения инфекции среди домашних свиней от острого со 100 % летальностью до хронического и бессимптомного носительства и непредсказуемого распространения. В естественных условиях к вирусу АЧС восприимчивы домашние и дикие свиньи всех возрастов. Экономический ущерб, наносимый АЧС, носит социальный и экономический характер и складывается из прямых потерь по тотальной ликвидации болезни, ограничений в международной торговле и измеряется сотнями миллионов долларов [2].

В ряде африканских стран и на итальянском острове Сардиния АЧС сохраняется в виде энзоотии. В России и бывшем СССР АЧС регистрировалась ранее, в 1977 г.. В результате заноса инфекции через порты Одессы были зарегистрированы 3 эпизоотические вспышки заболевания [3].

В 2007 г. АЧС зарегистрирована во всех районах Грузии, в Абхазии, Чечне, Южной и Северной Осетии, Армении. С 2008 г. вспышки АЧС регистрируются на территории Российской Федерации. Несмотря на предпринимаемые меры борьбы эпизоотическая ситуация по АЧС остаётся напряжённой.

В настоящее время нет эффективных способов профилактики и лечения данного заболевания. Ранняя диагностика АЧС максимально значима, поскольку позволяет определить наличие инфекционного агента на начальных этапах развития болезни и выработать оптимальную стратегию её искоренения. Своевременная и эффективная диагностика является важнейшей частью программы по искоренению этой болезни.

В настоящем обзоре рассмотрены основные молекулярно-генетические характеристики вируса АЧС, а также методы диагностики АЧС и особенности их применения.

Вирус АЧС — единственный представитель рода Asfvirus сем. Asfarviridae [1, 3]. Вирион имеет сложное внутреннее строение и внешнюю оболочку гексагонального сечения со средним размером 200 нм. В её формировании важную роль играет мембранный белок р54. В формировании зрелых инфекционных частиц икосаэдрической формы принимает активное участие трансмембранный белок р17, расположенный на внутренней поверхности оболочки вириона [4]. Геном вируса АЧС представлен двуцепочечной линейной молекулой ДНК, содержащей 170-190 тыс. п.н. в зависимости от штамма. ДНК кодирует более 100 белков. На концах генома расположены

инвертированные повторяющиеся последовательности, центральная часть размером около 125 тыс. п.н. консервативна, концевые области вариабельны. Консервативные гены сосредоточены в центральной области генома, между позициями 51 915 и 174 351 п.н.. В этой области находятся гены, кодирующие белки репликации ДНК, транскрипции РНК, а также структурные белки, белки модификации и сборки вирусных частиц (рис. 1). Левая вариабельная область, размером примерно в 55 тыс. п.н., правая — 12 тыс. п.н.. На рис. 1 пики указывают на области повышенной изменчивости генома. Левый и правый концы генома отмечены стрелками. Указаны имена вариабельных генов и регионов. Видно, что функции некоторых генов вируса АЧС не определены. Есть данные, подтверждающие эволюционную близость вируса АЧС с «гигантским» ДНК-содержащим вирусом HcDNAV, который размножается в океанском планктоне Heterocapsa circularisquama [5]. Фрагменты генов вируса АЧС идентичны ряду фрагментов неизвестных геномов, выявленных в сыворотках крови человека и в канализационных стоках, что свидетельствует о возможном существовании родственных вирусов [6]. Белки p72, p54, p30 и р12 обладают ярко выраженными антигенными свойствами и используются для серодиагностики [7]. Вирус АЧС адаптирован к различным перевиваемым клеточным линиям, включая VERO, CV, COS-1 [8-10]. В заражённых свиньях вирус размножается в мононуклеарных клетках и макрофагах [11], в клетках эндотелия [12], ренальных тубулярных эпителиальных клетках [13], гепатоцитах [14], нейтрофилах [15]. Не описано репликации вируса в Т- и В-лимфоцитах [13, 16]. Вирус также размножается в некоторых видах аргасовых клещей: Ornithodoros moubata, Ornitodorus erraticus и Ornitodorusporcinus [17-19].

Свиньи — единственные домашние животные, которые болеют АЧС. Для человека она не опасна. Дикие кабаны демонстрируют те же клинические проявления и уровни смертности, что и домашние свиньи [20, 21]. Африканские дикие свиньи (Phacochoerus aethiopicus, Hylochoerus meinertzhageni, Potamochoerus porcus) переносят инфекцию бессимптомно и являются, как и клещи, природным резервуаром вируса АЧС [22]. Источником возбудителя инфекции являются больные животные и вирусоносители, в особенности дикие и выжившие домашние свиньи, в организме которых вирус сохраняется до 15 мес.. Выявление животных-вирусоносителей серологическими методами весьма важно для программы борьбы с АЧС, оно сыграло важную роль в искоренении инфекции в Испании [23].

Вирус АЧС передаётся ороназальным путём, при всех видах инъекций, а также через укусы клещей [24, 25]. Вирус устойчив в окружающей среде. Его можно выделить из сыворотки крови спустя 18 мес. хранения при комнатной температуре. При 60 °С вирус

инактивируется за 30 мин [26], он чувствителен к дезинфектантам [27]. Вирус месяцами сохраняется в мясных продуктах и неопределённо долго в замороженном мясе [28, 29]. При производстве испанской вяленой свинины из заражённого сырья вирус инактивируется в процессе приготовления по разным данным в течение 112-140 сут. [30].

Рисунок 1. Вариабельность генома вируса Африканской чумы свиней (АЧС) (по материалам проф. Daniel Rock, США).

Инкубационный период АЧС длится от 4 до 19 сут.. Первичная репликация происходит в моноцитах и макрофагах в лимфоузлах, ближайших к месту проникновения вируса в организм. Затем вирус распространяется гематогенным и лимфогенным путём в лимфоузлы, костный мозг, селезёнку, лёгкие, печень, почки [21]. Виремия возникает через 4-8 сут. после заражения и продолжается в течение недель или даже месяцев, т.к. вируснейтрализующие антитела отсутствуют. Возникающая лимфопения предположительно связана с апоптозом. Отёк лёгких является главной причиной гибели животных, его связывают с активацией альвеолярных макрофагов [22, 31, 32]. По клиническим проявлениям АЧС зависит от вирулентности штамма, дозы и способа заражения. Болезнь может протекать в сверхострой, острой, подострой, хронической и латентной (бессимптомной) формах.

Вакцина для профилактики АЧС, на сегодняшний день, не разработана. Возможно, это связано с тем, что механизмы иммунного ответа на заражение вирусом АЧС недостаточно изучены. Вирус АЧС обладает выраженной антигенной активностью, вирусоспецифические ^М вырабатываются на 4 сут., а IgG — на 6-8 сут. после заражения [33]. Антитела сохраняются длительное время, их наличие связано с замедлением течения болезни, уменьшением уровня виремии, снижение летальности [34, 35]. В ранних экспериментах было показано отсутствие вируснейтрализующих антител, хотя переболевшие АЧС животные сохраняли способность вырабатывать нейтрализующие антитела в ответ на заражение другими патогенами [36].

Описано 22 генотипа вируса АЧС. На рис. 2 представлена дендрограмма, иллюстрирующая филогенетическое родство различных генотипов вируса АЧС. Филогенетическое родство определено методами секвенирования и сравнения первичных последовательностей генов различных полевых изолятов вируса АЧС и референс-штаммов вируса. Исследования по генотипированию, проведенные ранее, показали, что наиболее вероятным источником вируса АЧС для стран Европы, стали страны западного побережья Африки от Анголы на юге до Сенегала на севере [37].

мСЕ/94/1 SFEC26¿Genotype V!

Рисунок 2. Дендрограмма, иллюстрирующая филогенетическое родство различных генотипов вируса Африканской чумы свиней (АЧС). Стрелкой отмечен второй генотип, распространенный в Юго-Восточной Африке (Замбия, Мозамбик, Мадагаскар), Грузии, Армении, Азербайджане и России (любезно предоставлена проф. Trevor Drew, VLA, Великобритания).

В настоящее время, затруднительно назвать первоисточник, давший начало географически чрезвычайно широко представленному 1-му генотипу. Вспышки,

вызванные этим генотипом, охватывают значительный временной промежуток 19592000 гг.. Девять генотипов представлены на африканском континенте. Вспышки АЧС, происходившие в 1996-2000 гг. в Западной Африке, были вызваны генетически близкими вирусами, принадлежащими 1 -му генотипу, тогда как на Мадагаскаре, Южной Африке и в Ботсване — различными друг от друга генотипами — 2-м, 3-м, 4-м и 7-м, соответственно. В 2010 г. был проведен филогенетический анализ полноразмерных последовательностей генома 11 изолятов вируса АЧС, выделенных в различные годы на африканском континенте. Авторами было установлено, что наиболее вариабельным является левый концевой регион генома вируса АЧС [38]. Кроме того, разделение на генотипы на основе анализа полноразмерного генома позволило распределить исследуемые вирусные изоляты по 5 группам в отличие от 10 групп при анализе последовательности р72 [39].

Вирус, выявленный в Грузии в 2007 г., относится к генотипу II, который циркулирует в Мозамбике, Мадагаскаре и Замбии (рис. 2) [40, 41]. Его геном содержит 189 344 п.н., имеет 166 открытых трансляционных рамок. Проведение филогенетического анализа на базе 125 консервативных цистронов показало наиболее близкое сходство со штаммом Mkuzi 1979 [42]. Калабеков И.М. с соавт. (2010) представили результаты генотипирования 9 изолятов вируса АЧС, выделенных в 2007-2008 гг. при эпизоотических вспышках в Абхазии, Южной Осетии, Армении и различных регионах Российской Федерации на основе анализа нуклеотидных последовательностей участка гена p72 и полноразмерного гена, кодирующего белок p54 [40].

Очевидно, что филогенетический анализ и молекулярно-генетический анализ близких по структуре генов позволяет изучать связи между вирусами и их распространением в пространстве и времени.

Лабораторное подтверждение АЧС необходимо, т.к. клинические проявления болезни имеют сходство с симптомами классической чумы и целого ряда вирусных и бактериальных болезней. В случае подозрения на АЧС, в лабораторию доставляют следующие образцы: кровь с добавлением антикоагулянта (EDTA), сыворотку, селезёнку, лёгкое, почку, лимфатические узлы. В настоящее время, в ряде стран, включая Россию, разработаны эффективные современные лабораторные методы диагностики АЧС [43-45]. Сегодня имеется много диагностических методов разного

типа: вирусологический (выявление вируса и вирусных белков), молекулярный (выявление вирусной ДНК) и серологический (выявление специфических противовирусных антител) (табл. 1). Руководство по диагностическим тестам и вакцинам для наземных животных (Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals) подробно описывает диагностические протоколы OIE 2008, 2010 [46].

Таблица 1. Методы лабораторной диагностики Африканской чумы свиней (АЧС) [46].

Выявление вируса Характеристики

Реакция гемадсорбции (РГАд) Вирус АЧС выделяют на первичных макрофаговых культурах свиней. ВАЧС способен вызывать инфекцию и самореплицироваться естественным путём в культурах лейкоцитов периферийной крови свиней, где он вызывает не только цитопатический эффект в зараженных макрофагах, но и характерный гемадсорбционый эффект (РГАд) и клеточный лизис. Под микроскопом наблюдаются розетки красных кровяных телец, фиксирующихся на лейкоцитах. Техника гемадсорбции остается наиболее специфическим и высокочувствительным методом идентификации ВАЧС, так как ни один из других свиных вирусов такого эффекта не дает. Хотя гемадсорбция требует времени и больших трудозатрат сравнительно с другими методами диагностики (получение результатов требует 5-10 сут.), тем не менее он остается предпочтительной техникой перед другими, более скорыми методами диагностики. Важно отметить, что некоторые штаммы ВАЧС не способны к РГАд. В этом случае для подтверждения присутствия вируса обращаются к дополнительным анализам клеточного осадка посредством ПЦР или иммунофлуоресценции. Техника РГАд используется в настоящее только в Референтных лабораториях. РГАд требует 310 сут..

Реакция иммуно- флуоресценции (РИФ) Техника иммунофлуоресценции основывается на выявлении вирусных антигенов в ответ на окрашивание срезов, приготовленных в криостате, или калькирования тканей с анти-АЧС с добавлением флуоресцентного изотиоцината (FITC). Это очень простой, быстрый и чувствительный метод, который также может применяться в случае с клеточными культурами, зараженными пульпой из органов и тканей от подозреваемых на болезнь свиней. Под микроскопом зараженные клетки содержат цитоплазмические включения. При инфекции на продвинутой стадии специфическое свечение может принять зернистый вид. Если инфекция датируется более, чем 10 сут., когда появляются антитела, они могут заблокировать взаимодействие с коньюгатом, что дает ложноотрицательный результат. По этой причине РИФ используют параллельно с исследованиями на выявление антител (непрямая иммунофлуоресценция, ИФА, иммуноблоттинг). Рекомендуется использовать технику РИФ только тогда, когда отсутствует возможность постановки ПЦР или когда опыт её постановки ещё не наработан. Не следует забывать, что любой отрицательный результат должен подтверждаться, для чего рекомендуется параллельно осуществлять тест на выявление антител. РИФ требует 75 мин.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) ПЦР — высокочувствительная и специфическая техника, которая позволяет подтвердить присутствие вируса путём амплификации вирусной ДНК, содержащейся в пробе. Техника ПЦР использует затравки, соответствующие хорошо сохраняющемуся участку генома, что позволяет обнаруживать большую часть известных штаммов ВАЧС, как гемадсорбирующих, так и не гемадсорбирующих. Эта техника в настоящее время используется Справочными лабораториями для постановки вирусологического диагноза и подтверждения присутствия АЧС. Она может применяться как к пробам ткани, так и серопробам, взятым у животных с клиническими признаками болезни, поскольку продолжается виремия. Таким образом, техника ПЦР может использоваться для выявления присутствия вируса в крови со второго дня инфекции и до нескольких недель. В настоящее время ПЦР — широко используемая техника для целей этиологической диагностики, однако она требует хорошей подготовленности лабораторных специалистов. ПЦР требует от 5 до 6 ч.

Иммуно-ферментный анализ (ИФА) Для диагностики АЧС также были адаптированы такие методы, как сэндвич-ИФА (sandwich ELISA) и иммуноблоттинг. Однако они используются реже, так как, несмотря на свою повышенную чувствительность на ранней стадии инфекции, она сильно падает через 9-10 сут. после начала инфекции. Это объясняется тем, что происходит блокировка антителами, как то было указано выше в случае с РИФ. Широкого использования ИФА для определения антигена не приобрел. Эта техника занимает 3 ч.

Выявление антител Характеристики

Реакция непрямой иммунофлуо- ресценции (РНИФ) РНИФ — быстрая техника, показывающая высокую чувствительность и специфичность, при которой происходит реакция специфических антител, присутствующих в сыворотке или экссудате на клеточном покрове, зараженном вирусом АЧС. Реакция проявляется при добавлении иодопротеина А или флуоресцентно меченного второго антитела Anti-IgG свиньи. Если клеточный слой содержит положительные образцы на участках, близких к ядру, наблюдается свечение, которое соответствует точкам репликации ВАЧС. Техника РНИФ используется не очень широко в настоящее время. Коммерческие реактивы в торговле отсутствуют. Эта техника требует 2 ч.

Иммуно-ферментный анализ (ИФА) ИФА — метод, используемый для массовых профилактических и эпизоотических исследований. В применяемой в настоящее время технике ИФА используют растворимый антиген, содержащий большую часть вирусных протеинов АЧС. ИФА -высокочувствительный и специфический, быстрый, легкий метод. Разработан метод ИФА с неинфицированными реактивами, в котором в качестве вирусных антигенов применяются рекомбинантные протеины р32, р54 и рр72. Тестирование с помощью ИФА демонстрирует высокую чувствительность и специфичность, позволяющие исследовать плохо сохранившуюся сыворотку. ИФА широко используется в настоящее время. В продаже имеются диагностические наборы для постановки этого теста. ИФА требует 2 ч.

Иммуноблоттинг Иммуноблоттинг -техника, при которой вирусные протеины АЧС переносят на нитроцеллюлозные фильтры, выполняющие функцию антигенных полос, на которых происходит реакция подозрительной сыворотки с помощью коньюгата протеина А/ пероксидазы для выявления специфических антител. Техника иммуноблоттинг а используется для определения реактивности антител, присутствующих в сыворотке при контакте с различными протеинами, специфически производимыми вирусом африканской чумы свиней. Специфичность, чувствительность и объективный характер иммуноблоттинга делают его идеальной техникой серологической диагностики. Диагностические наборы для этой техники в продаже отсутствуют. Реактивы производятся в некоторых Референтных Лабораториях Европейского союза и МЭБ. Иммуноблоттинг -превосходная техника для серологического подтверждения в случае сомнительных результатов. Эта техника требует 3 ч.

При использовании реакции иммунофлуоресценции [47], в случае подострой и хронической форм течения болезни чувствительность метода снижается до 40 % из-за присутствия антител. Метод гемадсорбции [11, 48] обладает высокой чувствительностью, но не выявляет все штаммы вируса АЧС. Разработка и внедрение метода полимеразной цепной реакции с олигонуклеотидами, специфичными консервативному участку генома, позволяет выявлять все штаммы вируса АЧС с высокой чувствительностью.

В табл. 1 обобщены методы, используемые в настоящее время для целей диагностики АЧС, описаны их преимущества и недостатки, а также отмечены те из них, которые являются рекомендуемыми. При первом обследовании рекомендуется обращаться более, чем к одной технике диагностики. В любом случае, следует всегда ставить тесты параллельно, что позволяет одновременно обнаружить вирус и антитела. Наиболее часто используемыми сегодня методами являются: полимеразная цепная реакция (ПЦР) с последующим секвенированием и непрямой иммуноферментный анализ (ИФА) или иммуноблоттинг. На рис. 3 изображена схема, иллюстрирующая наиболее часто используемые в настоящее время лабораторные протоколы для выявления вируса АЧС и антител к нему.

Рисунок 3. Наиболее часто используемые лабораторные протоколы для определения вируса Африканской чумы свиней (АЧС) и антител к нему (по материалам проф. José Manuel Sánchez-Vizcaíno Rodríguez, Мадрид, Испания).

Сочетанное использование нескольких методов выявления антигена и антител позволяет рассчитать срок инфекции. Обнаружение антигена при отсутствии антител может свидетельствовать об инфекции менее 10-12 сут.. Идентификация антител может позволить также идентифицировать животных-носителей, так как они часто наблюдаются при длительной инфекции АЧС.

Выявление специфических к вирусу АЧС антител представляется важнейшей задачей. Во-первых, вакцины против АЧС не существует, следовательно, присутствие антител всегда является надежным свидетельством инфекции. Во-вторых, выработка антител происходит рано, и антитела сохраняются длительное время. В связи с этим, серологический мониторинг важен в системе мер борьбы с АЧС. На сегодняшний день, для серологических исследований применяют метод непрямой иммунофлуоресценции, непрямого твердофазного иммуноферментного анализа и иммуноблоттинга [46].

При искоренении АЧС в Испании первоначально проводили скрининг всех сывороток с помощью ИФА, с последующей проверкой положительных образцов иммуноблоттингом с использованием нитроцеллюлозных полосок, содержащих вирусные полипептиды с молекулярными массами 23-35 кДа [49]. При проведении исследований исследователи столкнулись с проблемой ложноположительных и ложноотрицательных результатов в ИФА. Было установлено, что ложноположительные результаты были получены при неправильном хранении сывороток, а ложноотрицательные результаты — из-за отсутствия антител на представляемые в ИФА вирусные эпитопы [50]. Исследования антигенной активности взаимодействия рекомбинантного белка р72 с антителами сывороток инфицированных АЧС свиней показали, что 100 нг рекомбинантного белка достаточно для чёткого определения позитивной сыворотки от негативной методом ИФА [51].

В АНО «НИИ диагностики и профилактики болезней человека и животных» совместно с испанской фирмой Ingenaza разработан отечественный набор для выявления антител к белку р72 вируса АЧС в сыворотках крови свиней конкурентным методом ИФА. Этот набор не уступает по чувствительности наборам на основе рекомбинантных белков за счет высокой концентрации хроматографически очищенного специфического антигена и использования моноклональных антител [52].

Показана эффективность использования рекомбинантного белка р30 для ИФА, а рекомбинантного белка р54 для иммуноблоттинга, что объясняется значительным количеством линейных и конформационных эпитопов, содержащихся в этих белках [53].

Актуальной также является разработка и совершенствование лабораторных методов экспресс-диагностики АЧС — создания иммунохроматографических тест-систем, позволяющих осуществить предварительную постановку диагноза в полевых условиях за 10-15 мин..

Основной проблемой, затрудняющей идентификацию и дифференциацию изолятов и штаммов вируса АЧС с использованием серологических реакций или методом биопробы, является наличие негемадсорбирующих вирулентных и авирулентных вариантов, а также изменчивость вируса. При минимальной концентрации возбудителя обнаружение его существующими модификациями серологических методов является затруднительным.

В последние годы, получили широкое развитие молекулярные методы выявления ДНК АЧС, такие как ПЦР, ПЦР в реальном времени. Они являются чувствительными, специфичными и занимают сравнительно мало времени от обработки проб до получения результата. Такие методы анализа генома как рестрикционный анализ, молекулярная гибридизация, полимеразная цепная реакция и секвенирование позволяют непосредственно исследовать структуру генома АЧС, изучить генетическую вариабельность, установить генетическую взаимосвязь штаммов вируса АЧС, проводить ретроспективный анализ геномов изолятов, выделенных в течение различного периода времени.

Для быстрого выявления вируса в пробах крови при острой и подострой формах заболевания могут быть использованы методы детекции вируса с ипользованием ПЦР и ПЦР в реальном времени [45, 54, 55].

Существует ряд зарубежных тест-систем на основе однораундовой ПЦР с последующей рестрикцией [54] на основе ПЦР в реальном времени [45, 55].

Разработаны отечественные тест-системы на основе ПЦР и ПЦР реальном времени для выявления ДНК вируса АЧС: АНО «НИИ диагностики и профилактики болезней человека и животных» совместно с ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России [21], ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, компании Интерлабсервис. Тест-система АНО «НИИ диагностики и профилактики болезней человека и животных» с высокой чувствительностью определяет ДНК вируса АЧС в крови, селезёнке, печени и мышечных тканях от латентно инфицированных, больных и павших животных, при этом, сокращено время анализа за счёт использования для выделения хроматографических колонок. При таком методе выделения, без потери чувствительности, время выделения сокращается более чем в 4 раза по сравнению с существующими Российскими тест-системами. Кроме того, комплектация тест-систем максимально приближена к европейскому стандарту.

АЧС, в первую очередь, дифференцируют от следующих болезней: классической чумы свиней, рожистого воспаления, сальмонеллёза, острого пастереллёза, стрептококковой инфекции, болезни Ауески, лептоспироза, дерматита с синдромом нефропатии свиней, мультисистемного послеотъёмного синдрома истощения, а также отравления кумарином [46]. При этом, используют методы выявления антигена вируса АЧС, такие, как ПЦР и ПЦР в реальном времени, РНИФ, ИФА. Наборы фирм Ingenaza и Иех, основанные на конкурентном

ИФА с моноклональными антителами к р72 позволяют выявлять наличие вируса в титрах 23 ^(ТСГО50)/мл, что сопоставимо с чувствительностью ПЦР, но в 10 раз меньше таковой при ПЦР в реальном времени. Высокая чувствительность указанного теста объясняется тем, что в инфицированных клетках происходит гиперпродукция основного капсидного белка р72.

Методы молекулярной диагностики позволяют быстро и эффективно выявить возбудитель, как на ранних стадиях болезни, так и при неясно выраженной клинической картине [55-59]. Кроме того, методы молекулярной диагностики позволяют выявить хронических носителей, а также дифференцировать возбудителей, при сходной клинической картине. Своевременная дифференциальная диагностика КЧС и АЧС максимально значима, поскольку позволяет определить наличие инфекционного агента на начальных этапах развития болезни и выработать оптимальную стратегию борьбы с данным заболеванием.

Таблица 2. Нормы и рекомендации МЭБ и другие нормативные положения по профилактике и планам борьбы с АЧС [46].

Международные нормы Санитарный кодекс наземных животных 2010, Всемирная организация здравоохранения животных (МЭБ), глава 15.1.

Руководство по диагностическим тестам и вакцинам для наземных животных, Всемирная организация здравоохранения животных (МЭБ), глава 2.1.12.

Нормы Европейского Союза Решение 2003 / 422 / СЕ Комиссии от 26 мая 2003 г. об апробации диагностического руководства по африканской чуме свиней.

Директива 2002 / 60 / СЕ Совета от 27 июня 2002 г., устанавливающая положения по борьбе с африканской чумой свиней во изменение директивы 92 / 119 / СЕ, посвящённой болезни Тешена и Африканской чуме свиней

В АНО «НИИ диагностики и профилактики болезней человека и животных» совместно с ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России разработана также тест-система для выявления и дифференциации вирусов АЧС и КЧС методом ПЦР. Тест-система проходит апробацию в широком производственном испытании.

Диагностические исследования — это один их важнейших пунктов в планах срочного реагирования для борьбы с АЧС. В табл. 2 резюмированы нормативные положения, выработанные МЭБ и Европейским Союзом в том, что касается предупреждения и планов борьбы с АЧС.

Очевидно, что раннее выявление болезни — наилучшее решение в деле защиты здоровья животных, при этом, оно представляет собой наиболее сложную составляющую любой эффективно действующей системы надзора за болезнью. Научные достижения последних

десятилетий обеспечили разработку методов лабораторной диагностики АЧС, обладающих не только высокой чувствительностью и специфичностью, но и быстрых в осуществлении. Большинство национальных и международных Референтных и региональных диагностических лабораторий располагает методами, позволяющими ставить точный диагноз всего за несколько часов. Между тем, время, необходимое для обнаружения болезни на месте или, по крайней мере, выявления подозрения на нее — представляет пока основную трудность [46]. Следовательно, оперативная и эффективная постановка диагноза позволяет сдержать распространение инфекции и без промедления обратиться к мерам борьбы, т.к. эти факторы более других важны для понимания эволюции болезни и решения проблемы по её искоренению.

1. Murphy F.A., Fauquet C.M., Bishop D.H.L., Ghabrial S.A., Jarvis A.W., et al. Virus taxonomy, 6th report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Arch. Virol. 1995; Supplement 10.

2. United States Department of Agriculture (USDA), 2011. Russian Federation. Global Agricultural Information Network, Report RS1144, 2011. Foreign Agriculture Services. www.thepigsite.com, 2011. Доклад размещён на сайте: http://www.thepigsite.com/articles/3624/russian-federation-livestock-and-products-annual-2011.

3. ЛьвовД.К., Альховский С.В., ЩелкановМ.Ю. Асфарвирусы (Asfarviridae). В кн.: Руководство по вирусологии. Вирусы и вирусные инфекции человека и животных. Ред.: академик РАНД.К. Львов. М.: МИА, 2013; 152-154.

4. Suárez C., Gutiérrez-Berzal J., Andrés G., SalasM.L., Rodríguez J.M. African swine fever virus protein p17 is essential for the progression of viral membrane precursors toward icosahedral intermediates. J. Virol. 2010; 84 (15) : 7484-7499.

5. Ogata H., ToyodaK., Tomaru Y., Nakayama N., Shirai Y., et al. Remarkable sequence similarity between the dinoflagellate-infecting marine virus and the terrestrial pathogen African swine fever virus. Virol. J. 2009; 6 : 178.

6. Loh J., Zhao G., Presti R.M., Holtz L.R., Finkbeiner S.R., et al. Detection of novel sequences related to African Swine Fever virus in human serum and sewage. J. Virol. 2009; 83 (24) : 1301913025.

7. Arias M., Sánchez-Vizcaíno J.M. African Swine Fever Eradication: The Spanish model. Trends in Emerging Viral Infections of Swine. 2002; 133-139.

8. Carrascosa A.L., Bustos M.J., de Leon P. Methods for growing and titrating African swine fever virus: field and laboratory samples. Curr. Protoc. Cell Biol. 2011; Ch. 26 : Unit 26.14.

9. Hess W.R., Cox B.F., Heuschele W.P., Stone S.S. Propagation and modification of African swine fever virus in cell cultures. Am. J. Vet. Res. 1965; 26 : 141-146.

10. Hurtado C., Bustos M.J., Carrascosa A.L. The use of COS-1 cells for studies of field and laboratory African swine fever virus samples. J. Virol. Methods. 2010; 164 (1-2) : 131-134.

11. Malmquist W.A., Hay D. Hemadsorption and cytopathic effect produced by African Swine Fever virus in swine bone marrow and buffy coat cultures. Am. J. Vet. Res. 1960; 21 : 104-108.

12. Wilkinson P.J., Wardley R.C. The replication of African swine fever virus in pig endothelial cells. Br. Vet. J. 1978; 134 (3) : 280-282.

13. Gómez-Villamandos J.C., Hervás J., Méndez A., Carrasco L., Martín de lasMulas J., et al. Experimental African swine fever: apoptosis of lymphocytes and virus replication in other cells. J. Gen. Virol. 1995; 76 (9) : 2399-2405.

14. SierraM.A., Bernabe A., Mozos E., Mendez A., Jover A. Ultrastructure of the liver in pigs with experimental African swine fever. Vet. Pathol. 1987; 24 (5) : 460-462.

15. Gómez-Villamandos J.C., BautistaM.J., Carrasco L., Caballero M.J., Hervás J., et al. African swine fever virus infection of bone marrow: lesions and pathogenesis. Vet. Pathol. 1997; 34 (2) : 97-107.

16. Minguez I., Rueda A., Dominguez J., Sánchez-Vizcaíno J.M. Double labeling immunohistological study of African swine fever virus-infected spleen and lymph nodes. Vet. Pathol. 1988; 25 : 193198.

17. Plowright W., Perry C.T., Peirce M.A., Parker J. Experimental infection of the argasid tick, Ornithodoros moubata porcinus, with African swine fever virus. Arch. Gesamte Virusforsch. 1970; 31 (1) : 33-50.

18. Ravaomanana J. , Michaud V. , Jori F. , Andriatsimahavandy A. , Roger F. , et al. First detection of African Swine Fever Virus in Ornithodoros porcinus in Madagascar and new insights into tick distribution and taxonomy. Parasit. Vectors. 2010; (3) : 115.

19. Sanchez-Botija C. Reservorios del virus de la Peste Porcina Africana. Investiga- cion del virus de la PPA en los artropodos mediante la prueba de la hemoadsorcion. Bull OIE . 1963; 60 : 895-899.

20. Балышев В.М., Куринов В.В., Цыбанов С.Ж., Калантасико Ю.Ф., Колбасов Д.В. и др. Биологические свойства вируса африканской чумы свиней, выделенного в Российской Федерации. Ветеринария. 2010; (7) : 25-27.

21. Забережный А.Д., Алипер Т.И., Гребенникова Т.В., Верховский О.А., Sánchez-Vizcaíno J.M., et al. Африканская чума свиней в Российской Федерации. Вопросы вирусологии. 2012; (5) : 4-9.

22. Алипер Т.И., Забережный А.Д., Гребенникова Т.В. Африканская чума свиней в Российской Федерации. Вопросы вирусологии. 2012; Приложение 1 : 127-136.

23. Arias M., Sánchez-Vizcaíno J.M. Manual de diagnóstico serológico de la Peste porcina africana. Monografías INIA. 1992; 83 : 5-44.

24. Colgrove G., Haelterman E.O., Coggins L. Pathogenesis of African swine fever virus in young pigs. Am. J. Vet. Res. 1969; 30 : 1343-1359.

25. Plowright W., Parker J., Staple R.F. The growth of a virulent strain of African swine fever virus in domestic pigs. J. Hyg. (Lond). 1968; 66 (1) : 117-134.

26. Plowright W., Parker J. The stability of African swine fever virus with particular reference to heat and pH inactivation. Arch. Gesamte Virusforsch. 1967; 21 : 383-402.

27. KrugP.W., Larson C.R., Eslami A.C., RodriguezL.L. Disinfection of foot-and-mouth disease and African swine fever viruses with citric acid and sodium hypochlorite on birch wood carriers. Vet. Microbiol. 2012; 156 (1-2) : 96-101.

28. Pharo H., Cobb S.P. The spread of pathogens through trade in pig meat: overview and recent developments. Rev. Sci. Tech. 2011; 30 (1) : 139-148.

29. Wieringa-Jelsma T., Wijnker J.J., Zijlstra-Willems E.M., Dekker A., Stockhofe-Zurwieden N., et al. Virus inactivation by salt (NaCl) and phosphate supplemented salt in a 3D collagen matrix model for natural sausage casings. Int. J. Food Microbiol. 2011; 148 (2) : 128-134.

30. Mebus C., House C., Ruiz F. Survival of foot-and -mouth disease, African swine fever and hog cholera virus in Spanish serrano cured hams and Iberian cured hams, shoulder and loin. Food Microbiol. 1993; 10 : 133-143.

31. Carrasco L. , Chacon M. , Lara J. Virus association with lymphocytes in acute African swine fever. Vet. Res. 1996; 27 : 305-312.

32. SierraM.A., Carrasco L., Gómez-Villamandos J.C., Martin de lasMulas J., Méndez A., Jover A. Pulmonary intravascular macrophages in lungs of pigs inoculated with African swine fever virus of differing virulence. J. Comp. Pathol. 1990; 102 (3) : 323-334.

33. Sánchez-Vizcaíno J.M., Slauson D.O., Ruiz-Gonzalvo F., Valero F. Lymphocyte function and cell-mediated immunity in pigs with experimentally induced African swine fever. Am. J. Vet. Res. 1981; 42 : 1335-1341.

34. OniskD., BorcaM., Kutish G., Kramer E., IrustaP., RockD.L. Passively transferred African swine fever virus antibodies protect swine against lethal infection. Virology. 1994; 198 : 350-354.

35. SchlaferD.H., Mebus C.A., McVicar J.W. African swine fever in neonatal pigs: Passive acquired protection from colostrum or serum from recovered pigs. Am. J. Vet. Res. 1984; 45 : 1367-1372.

36. De Boer C.J. Studies to determine neutralizing antibody in sera from animals recovered from African swine fever and laboratory animals inoculated with African virus with adjuvants. Arch. Gesamte Virusforsch. 1967; 20 (2) : 164-179.

37. Lubisi B.A., Bastos A.D.S., Dwarka R.M., Vosloo W. Molecular epidemiology of African swine fever in East Africa. Arch. Virol. 2005; 150 : 2439-2452.

38. Villiers E.P., Gallardo C., AriasM., Melissa da Silva, Upton C., et al. Phylogenomic analysis of 11 complete African swine fever virus genome sequences. Virol. 2010; (400) : 128-136.

39. Bastos A.D.S., Penrith M.L., Cruciere C., Edrich J.L., Hutchings G., et al. Genotyping field strains of African swine fever virus by partial p72 gene characterisation. Arch. Virol. 2003; 148 : 693-706.

40. Калабеков И.М., Елсукова А.А., Шендрик А.Г. и др. Филогенетический анализ полевых изолятов вируса африканской чумы свиней. Ветеринария. 2010; (5) : 31-33.

41. Rowlands R.J., Michaud V., Heath L., Hutchings G., Oura C., et al. African swine fever virus isolate, Georgia, 2007. Emerg. Infect. Dis. 2008; 14 (12) : 1870-1874.

42. Chapman D.A., Darby A.C., Da SilvaM., Upton C., RadfordA.D., Dixon L.K. Genomic analysis of highly virulent Georgia 2007/1 isolate of African swine fever virus. Emerg. Infect. Dis. 2011; 17 (4) : 599-605.

43. Куринов В.В., Колбасов Д.В., Цыбанов С.Д., Калабеков И.М., Лыска В.М. и др. Диагностика и мониторинг при вспышках африканской чумы свиней в Республиках Кавказа. Ветеринария. 2008; (10) : 20-25.

44. Ronish B., HakhverdyanM., StahlK., Gallardo C., Fernandez-Pinero J., et al. Design and verification of a highly reliable Linear-After-The-Exponential PCR (LATE-PCR) assay for the detection of African swine fever virus. J. Virol. Methods. 2011; 172 (1-2) : 8-15.

45. Tignon M., Gallardo C., Iscaro C., Hutet E., Van der Stede Y., et al. Development and inter-laboratory validation study of an improved new real-time PCR assay with internal control for detection and laboratory diagnosis of African swine fever virus. J. Virol. Methods. 2011; 178 (12) : 161-170.

46. OIE. José Manuel Sánchez-Vizcaíno Rodríguez, Laboratorio de Referencia de la OIE para Peste Porcina Africana,Universidad Complutense de Madrid, Facultad de Veterinaria, Avda. Puerta de Hierro s/n, 28040 Madrid-Conf OIE. 2010; 159-168.

47. Bool P., Ordás A., Sánchez-Botija C. The diagnosis of African swine fever by immunofluorescence. Bull OIE. 1969; 72 : 819-839.

48. Середа А.Д., Балышев В.М. Антигенное разнообразие вирусов африканской чумы свиней. Вопросы вирусологии. 2011; 56 (4) : 38-42.

49. Alcaraz СЛ., De DiegoM., Pastor M.J., Escribano J.H. Comparison of a radioimmunoprecipitation assay to immunoblotting and ELISA for detection of antibody to an african swine fever virus. J. Vet. Diagn. Invest. 1990; (2) : 191-196.

50. Bech-Nielsen S., AriasM.L., Panadero J., et al. Laboratory diagnosis and disease occurrence in the current african swine fever eradication program in Spain 1989-1991. Prevent. Vet. Med. 1993;17 : 225-234.

51. Garcia-Escudero R., Andres G., Almazan F., Vinuela E. Inducible gene expression from African swine fever virus recombinants: analysis of the major capsid protein p72. J. Virol. 1998; 72 : 3185-3195.

52. Цибезов В.В., Терехова Ю.О., Баландина М.В., Латышев О.Е., Гребенникова Т.В. и др. Разработка иммуноферментных методов диагностики африканской сумы свиней. Ветеринария Кубани. 2012; (1) : 20-23.

53. Perez-Filgueira D.M., Gonzalez-Camacho F., Gallardo C., Resino-Talavan P., Blanco E., et al. Optimization and validation of recombinant serological tests for African swine fever diagnosis based on detection of the p30 protein produced in Trichoplusia ni larvae. J. Clin. Microbiol. 2006; 44 (9) : 3114-3121.

54. Aguero M., Fernandez J., Romero L., SanchezMascaraque C., AriasM., Sanchez-Vizcaino J.M. Highly sensitive PCR assay for routine diagnosis of African swine fever virus in clinical samples. J. Clin. Microbiol. 2003; (41) : 4431-4434.

55. McKillen J., McMenamy M., Hjertner B., McNeilly F., UttenthalA., et al. Sensitive detection of African swine fever virus using real-time PCR with a 5′-conjugated minor groove binder probe. J. Virol. Methods. 2010; 168 (1-2) : 141-146.

56. EberlingA.J., Bieker-Stefanelli J., ReisingM.M., Siev D., Martin B.H., et al. Development, optimization, and validation of a Classical swine fever virus real-time reverse transcription polymerase chain reaction assay. J. Vet. Diagn. Invest. 2011; 23 (5) : 994-998.

57. Hoffmann B., Blome S., Bonilauri P., Fernandes-Pinero J., Greiser-Wilke I., et al. Classical swine fever virus detection: results of a real-time reverse transcription polymerase chain reaction ring trial conducted in the framework of the European network of excellence for epizootic disease diagnosis and control. J. Vet. Diagn. Invest. 2011; 23 (5) : 999-1004.

58. Leifer I., Blome S., BeerM., HoffmannB. Development of a highly sensitive real-time RT-PCR protocol for the detection of Classical swine fever virus independent of the 5′ untranslated region. J. Virol. Methods. 2011; 171 (1) : 314-317.

59. Liu L., Xia H., Everett H., Sosan O., Crooke H. A generic real-time TaqMan assay for specific detection of lapinized Chinese vaccines against classical swine fever. J. Virol. Methods. 2011; 175 (2):170-174.

Смотрите так же:

  • Синдром китайского ресторана что это Синдром китайского ресторана 1. Малая медицинская энциклопедия. — М.: Медицинская энциклопедия. 1991—96 гг. 2. Первая медицинская помощь. — М.: Большая Российская Энциклопедия. 1994 г. 3. Энциклопедический словарь медицинских терминов. — […]
  • Деревенские куры новосибирск Выгодное содержание кур на участке Переезжая в деревню, люди чаще всего своей первой животинкой заводят кур. Содержание курочек на подворье не требует больших затрат, отдача от кур моментальная — каждый день свежие домашние […]
  • Тошнота понос острая боль в животе Почему появляются тошнота, понос, слабость и боль в животе? Понос, тошнота, боль в животе сигнализируют о нарушении процесса пищеварения. При появлении таких характерных признаков, скорее всего, причина кроется в бактерии, которая попала […]
  • Сп профилактика кори и краснухи Профилактика кори, краснухи и эпидемического паротита ГЛАВНЫЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ САНИТАРНЫЙ ВРАЧ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ПОСТАНОВЛЕНИЕ от 28 июля 2011 г. N 108 ОБ УТВЕРЖДЕНИИ СП 3.1.2952-11 "ПРОФИЛАКТИКА КОРИ, КРАСНУХИ И ЭПИДЕМИЧЕСКОГО […]
  • Причины болей живота после еды Причины появления в желудке болей после еды и что делать К врачу-гастроэнтерологу пациенты нередко обращаются с жалобой на боль в желудке после еды. Болезненные приступы имеют разные причины, локализацию, интенсивность и характер, но […]